Efeito de protocolo hormonal e programa de luz artificial na gestação de éguas receptoras de embrião durante o período de transição de primavera / Effect of hormonal protocol and artificial light program on the pregnancy of embryo recipient mares during spring transition period

O objetivo do estudo foi comparar o efeito das técnicas hormonais e de luz artificial nas éguas receptoras de embrião acíclicas avaliando as taxas de gestação aos 14 e 28 dias durante a fase de transição de primavera. Os 48 animais foram distribuídos aleatoriamente nos grupos: controle (CONT, n=16), éguas cíclicas na fase ovulatória; luz artificial (LUZ, n=16), éguas acíclicas submetidas ao tratamento de luz artificial; e hormônio (HORM, n= 16), éguas acíclicas submetidas ao protocolo hormonal na fase de transição. As éguas do grupo LUZ foram estimuladas por 60 dias com luz artificial durante cinco horas por dia. Nos grupos CONT e LUZ, quando observada a presença de folículo ≥ 35 mm de diâmetro e edema uterino ≥ grau II, foram administrados 1,5 mg de acetato de deslorelina e 1500 UI de hCG para induzir a ovulação. As éguas do grupo HORM foram tratadas com três doses de 1,5 mg de benzoato de estradiol e seguiram os mesmos protocolos dos Grupos CONT e LUZ. Foi avaliada a taxa de gestação por ultrassonografia aos 14 dias e confirmação aos 28 em todos os grupos experimentais. Foi realizada análise descritiva e teste Qui-quadrado (significância de 5%). Taxas de gestação aos 14 e 28 dias foram semelhantes (p>0,05) entre todos os grupos. Os tratamentos HORM e LUZ durante o período de transição inverno-primavera mostraram-se eficazes para atender ao programa de transferência de embrião. Por ser um método mais natural, o protocolo LUZ tem potencial como mais uma ferramenta biotecnológica na reprodução de equinos.

The aim of this study was to compare the effect of hormonal and artificial light techniques on acyclic embryo recipient mares by assessing pregnancy rates at 14 and 28 days during the spring transition period. The 48 animals were randomly assigned to the groups: control (CONT, n = 16), cyclic mares in the ovulatory phase; artificial light (LIGHT, n = 16), acyclic mares subjected to artificial light treatment; and hormone (HORM, n = 16), acyclic mares submitted to hormonal protocol in transition phase. In the LIGHT group, mares were stimulated with artificial light for five hours a day, for 60 days. In CONT and LIGHT groups, when a follicle ≥ 35 mm in diameter and uterine edema ≥ grade II were observed, 1.5 mg of deslorelin acetate and 1500 IU hCG were administered to induce ovulation. In the HORM group, mares were treated with three doses of 1.5 mg of estradiol benzoate and followed the same protocols as the CONT and LIGHT groups. Pregnancy rate was assessed by ultrasound at 14 days and confirmation at 28 days in all experimental groups. Descriptive analysis and chi-square test (5% significance) were performed. Pregnancy rates at 14 and 28 days were similar (p> 0.05) among all groups. The HORM and LIGHT treatments during the winter-spring transition period proved to be effective during the embryo transfer programs. As it is a more natural method, the LIGHT protocol has the potential to be one more biotechnological tool in equine reproduction.

Efficacy and limitations of different approaches to anticipate the diagnosis of pregnancy in cattle / Eficácia e limitações de diferentes abordagens para antecipar o diagnóstico de gestação em bovinos

The study evaluated sonographic and serologic exams performed for early (20 to 30d) diagnosis of pregnancy. One hundred-twenty (n= 120) bovine recipients were synchronized (estrous=D0) and timed embryo transferred (TET, D7) with fresh in vitro produced embryos. In the first trial (n= 46), diagnosis of pregnancy was performed on day 20 (D20) by detecting CL blood flow (BF) and by Pregnancy-Associated Glycoproteins (PAGs) serology. In the second trial (n= 30), pregnancy diagnosis was performed on D25 by ultrasound visualization of uterine contents and by PAGs serology. In the last trial, PAG's serology was performed on D30. Ultrasonographic detection of the uterine contents and embryo viability performed on D30 (DG30) was considered the gold standard. The PROC FREQ procedure was used to test the agreement between diagnostic methods. On D20, the Doppler ultrasonography of the CL had showed high sensitivity (100%), but only moderate specificity (53.3%). On the same day, serologic diagnostic had no agreement (k= -0.08, P< 0.46) with the gold standard, with very low sensitivity (6.3%). However, the sensitivity of the serologic exam increased dramatically (from 6.3 to 100%) from D20 to D25, and it contributed to detect false negatives from the ultrasound diagnosis, improving the overall accuracy from 90% to 96.7%.(AU)

O estudo foi planejado para correlacionar exames ultrassonográficos e sorológicos realizados para o diagnóstico precoce (20 a 30d) de gestação. Cento e vinte (n= 120) receptoras bovinas foram sincronizadas (estro=D0), e embriões frescos produzidos in vitro foram transferidos em tempo fixo (TETF, D7). No experimento 1 (n= 46), o diagnóstico de gestação foi realizado no D20, pela detecção do fluxo sanguíneo do CL e pela sorologia de glicoproteínas associadas à gestação (PAGs). No experimento 2 (n= 30), a detecção da gestação foi realizada por meio da visualização do conteúdo do útero e também pela sorologia para PAGs. No experimento 3, a sorologia para PAGs foi realizada no D30. Em todos os experimentos, a visualização ultrassonográfica da vesícula e da viabilidade embrionária, realizada no D30, foi considerada padrão-ouro. O procedimento PROC FREQ testou o nível de concordância dos métodos diagnósticos. No D20, o diagnóstico baseado na vascularização do CL mostrou alta sensibilidade (100%) e apenas moderada especificidade (53,3%). Nesse mesmo dia, o diagnóstico sorológico não apresentou concordância (k=-0,08, P<0,46) com o padrão-ouro, além de baixa sensibilidade (6,3%). No entanto, a sensibilidade do exame sorológico aumentou drasticamente (6,3 para 100%) do D20 para o D25, contribuindo para detectar falsos negativos diagnosticados pela ultrassonografia, melhorando a acurácia (90 para 96,7%).(AU)

Decontamination of genetically modified mice strains by embryo transfer for obtaining SPF colonies in a Brazilian animal facility / Descontaminação de linhagens de camundongos geneticamente modificadas por transferência embrionária para obtenção de colônias SPF em um biotério brasileiro (São Paulo, SP)

The introduction of new strains of mice in specific pathogen-free (SPF) animal facilities should be performed carefully to avoid breaking sanitary barriers. To meet this need, animals should be rederived to reduce infection risk and thus avoid research interference caused by loss of animal health status and welfare. The objective of this study was to implement mice embryo transfer in the laboratory mouse facility of the Department of Immunology at the Institute of Biomedical Sciences/University of São Paulo, Brazil. Embryo transfers were performed to rederive genetically modified mouse strains with undefined sanitary status, received from different research and educational institutions. Fertilized eggs at two-cell stage were obtained by natural means and transferred into the oviducts of SPF pseudo-pregnant female mice. All surgical procedures were performed under aseptic conditions. A total of 625 embryos were transferred into the recipients. 148 pups were born, of which 140 were reared. Viruses, bacteria and intestinal protozoa were eliminated using this technique. The improvement in the microbiological status of mice allowed their expansion in our SPF facility. With these results, we can stimulate the use of embryo transfer technique between rodent facilities in Brazil and thus encourage the distribution of better models to our scientific community.(AU)

A introdução de novas linhagens de camundongos em biotérios livres de patógenos específicos (SPF) deve ser realizada com critérios para evitar a quebra das barreiras sanitárias. Dessa forma, os animais devem ser rederivados para reduzir os riscos de infecção e evitar as interferências provocadas pela perda do status sanitário e do bem-estar dos animais. O objetivo deste estudo foi implementar a transferência de embriões murinos no Biotério do Departamento de Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, Brasil. As transferências embrionárias foram realizadas para rederivar linhagens de camundongos geneticamente modificadas com status sanitário não conhecido, recebidas de diferentes instituições de pesquisa e de ensino. Os embriões em duas células foram obtidos pelos métodos naturais e transferidos para os ovidutos de fêmeas de camundongos SPF pseudoprenhas. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob condições assépticas. Um total de 625 embriões foram transferidos para as receptoras. Foram obtidos 148 filhotes nascidos vivos, destes 140 foram desmamados. Por meio desta técnica, foram eliminados vírus, bactérias e protozoários intestinais. A melhora no status microbiológico dos camundongos permitiu a expansão destes em nossa colônia SPF. Com esses resultados, podemos promover o uso da técnica de transferência de embriões entre os biotérios brasileiros e assim incentivar a distribuição de modelos mais adequados para a nossa comunidade científica.(AU)

Taxa de recuperação e características morfológicas de embriões muares (Equus caballus x Equus asinus) / Recovery rate and morphologic features of cross bred embryos (Equus caballus x Equus asinus)

A Transferência de Embrião (TE) contribuiu efetivamente para a produção de equinos e outras espécies. O mercado de muares tem apresentado um contínuo crescimento, entretanto, a aplicação das biotecnologias para a produção desses animais ainda é escassa. O presente estudo avaliou a taxa de recuperação embrionária e as características dos embriões provenientes do cruzamento de éguas com jumentos. Os embriões foram recuperados entre os dias 6 e 9 após a ovulação, dessa forma foi realizada a avaliação da taxa de recuperação embrionária e avaliação das características relacionadas com a idade, morfologia e diâmetro embrionário. A taxa de recuperação embrionária total foi de 55,9% (71/127), e não apresentou diferença para as colheitas realizadas em diferentes dias (D6-D9). Foram recuperados embriões nos estágios de mórula, blastocisto inicial, blastocisto e blastocisto expandido. O tamanho dos embriões variou entre 147-1688μm e a média do diâmetro de todos os embriões recuperados foi de 438,04μm. A recuperação de embriões muares pode ser realizada entre os dias 6 e 9 após a ovulação, e propicia a recuperação de embriões nos primeiros estágios de desenvolvimento.(AU)

Production biotechnologies, particularly embryo transfer (ET) has constantly been contributed to reproduce horses and other species. The mules market has shown continuous growth, however, the biotechnology for mule assisted reproduction is still scarce. The aim of this study was to evaluate the embryo recovery rate and the features of the embryos from mares bred with donkeys. The embryos recovery attempts were performed on days 6 to 9 after ovulation, in order to evaluate the embryo recovery rate and the features related to age, morphology and embryonic diameter in each day. The overall embryo recovery rate was 55,9% (71/127), and there was no significant difference (p>0,05) on different days (D6-D9). Embryos were recovered in stages of mórula, early blastocyst, blastocyst and expanded blastocyst. The diameter of the embryos ranged from 147-1688μm and the mean diameter of all the embryos collected was 438,04μm. The collection of hybrid embryos might be performed between days 6 and 9 after ovulation, and provides recovery of embryos in the early stages of development.(AU)

Freezing goat embryos at different developmental stages and quality using ethylene glycol and a slow cooling rate / Congelação de embriões caprinos em diferentes estádios de desenvolvimento e qualidade utilizando etileno glicol e taxa de resfriamento lenta

The efficiency of an alternative freezing protocol for goat embryos of different morphology and quality was tested. Fifty-eight embryos on Day 6-7 stage were transferred as fresh or after freeze-thawing (n=29/group). For freezing, embryos were placed into 1.5M ethylene-glycol solution for 10min. During this time, they were loaded in the central part of 0.25mL straw, separated by air bubble from columns containing PBS/BSA 0.4% plus 20% BFS. Straws were then frozen using a freezing machine from 20ºC to -6ºC at a cooling rate of 3ºC/min, stabilization for 15min (seeding after 5min), from -6 C to -32ºC at 0.6 C/min,and plunged into liquid nitrogen. Frozen embryos were thawed for 30s at 37ºC in a water bath. Embryos subjected to fresh transfer were maintained in holding medium (37ºC). Fresh and frozen-thawed embryos were transferred at day 7 post-estrus to 30 recipients. Kidding and kid born rates were similar (P> 0.05), respectively, for recipients receiving fresh (66.7% or 10/15; 55.2% or 16/29) or frozen-thawed (60% or 9/15; 51.7% or 15/29) embryos. The cryopreservation of goat embryos using slow-freezing protocol and 1.5MEG resulted in similar efficiency rates of fresh embryos.(AU)

Este estudo testou a eficiência de protocolo alternativo de criopreservação de embriões caprinos de diferentes qualidades morfológicas. Foram utilizados 58 embriões, coletados entre o sexto e o sétimo dia do ciclo estral (n=29/grupo). Embriões congelados passaram por solução 1,5M etilenoglicol por 10min e foram aspirados durante esse tempo para parte central de palheta 0,25mL, separada por bolhas de ar de colunas contendo PBS 0,4% BSA e 20% SFB. As palhetas foram congeladas em máquina de congelação de 20ºC a -6ºC, com taxa de resfriamento de 3ºC/min, estabilização por 15min (seeding após 5min), -6ºC a -32ºC a 0,6ºC/min, e imersas em nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 30s a 37ºC, em água. Embriões frescos foram mantidos em solução de manutenção (37ºC). Embriões frescos e congelados/descongelados foram transferidos para 30 receptoras no sétimo dia do ciclo estral. A taxa de partos e a de crias nascidas (respectivamente) foram similares (P>0,05) para receptoras recebendo embriões frescos (66,7% ou 10/15; 55,2% ou 16/29) ou congelados/descongelados (60,0% ou 9/15; 51,7% ou 15/29). O protocolo de criopreservação de embriões utilizado no presente estudo resultou em índices de eficiência semelhantes aos de embriões frescos.(AU)

Follicle and corpus luteum size and vascularity as predictors of fertility at the time of artificial insemination and embryo transfer in beef cattle / Tamanho e vascularização do folículo e corpo lúteo como preditores de fertilidade após inseminação artificial e transferência de embriões em gado de corte

Two ultrasound based fertility prediction methods were tested prior to embryo transfer (ET) and artificial insemination (AI) in cattle. Female bovines were submitted to estrous synchronization prior to ET and AI. Animals were scanned immediately before ET and AI procedure to target follicle and corpus luteum (CL) size and vascularity. In addition, inseminated animals were also scanned eleven days after insemination to target CL size and vascularity. All data was compared with fertility by using gestational diagnosis 35 days after ovulation. Prior to ET, CL vascularity showed a positive correlation with fertility, and no pregnancy occurred in animals with less than 40% of CL vascularity. Prior to AI and also eleven days after AI, no relationship with fertility was seen in all parameters analyzed (follicle and CL size and vascularity), and contrary, cows with CL vascularity greater than 70% exhibit lower fertility. In inseminated animals, follicle size and vascularity was positive related with CL size and vascularity, as shown by the presence of greater CL size and vascularity originated from follicle with also greater size and vascularity. This is the first time that ultrasound based fertility prediction methods were tested prior to ET and AI and showed an application in ET, but not in AI programs. Further studies are needed including hormone profile evaluation to improve conclusion.

Duas técnicas de predição de fertilidade, baseadas em ultrassonografia, foram testadas no momento da transferência de embriões (TE) e inseminação artificial (IA) em bovinos. Fêmeas bovinas foram submetidas a protocolos de sincronização de estro para TE e IA. Os animais foram escaneados por ultrassonografia imediatamente antes do procedimento de TE e IA para identificar o tamanho e vascularização do folículo e corpo lúteo (CL). Além disso, os animais inseminados foram escaneados onze dias após a inseminação para identificar o tamanho e vascularização do CL. Todos os dados foram comparados com a fertilidade utilizando-se do diagnóstico gestacional 35 dias após a ovulação. No momento da TE, a vascularização do CL apresentou-se positivamente relacionada com a fertilidade, sendo que animais com menos de 40% de vascularização do CL não ficaram gestantes. No momento da IA, assim como onze dias após a IA, nenhuma relação foi encontrada entre fertilidade e os parâmetros analizados (tamanho e vascularização do folículo e CL), enquanto que contrariamente, houve uma queda na fertilidade em vacas com vascularização do CL acima de 70%. Nos animais inseminados, o tamanho e vascularização do folículo foi positivamente relacionado ao tamanho e vascularização do CL, demonstrado pela presença de um CL maior e mais vascularizado proveniente de um folículo maior e mais vascularizado. O presente estudo é o primeiro a mostrar métodos de predição de fertilidade baseados em ultrassonografia no momento da IA e TE, demonstrando uma aplicabilidade prática no momento da TE. Novos estudos são necessários para suportar os resultados mostrados, incluindo análises hormonais.

Reproductive efficiency of asymptomatic Theileria equi carriers mares submitted to an embryo transfer program / Eficiência reprodutiva de éguas portadoras assintomáticas de Theileira equi submetidas a um programa de transferência de embriões

This study aimed to assess and evaluate the effects of Theileria equi infection on embryonic recovery, gestation and early embryonic loss. Thirteen Mangalarga Marchador Theileria equi positive donors (diagnosed through nested-PCR) and 40 embryos receptors were used. Donors were submitted to two embryo collections in two consecutive estrous cycles (GId); after, the same mares were treated with imidocarb dipropionate (1.2mg/kg IM.) in order to collect more embryos in two more estrous cycles (GIId). Receptors were divided into two groups (control and with treated) with 20 animals each, where one group was the control (GIr) and the other one (GIIr) treated with 1.2mg/kg IM of imidocarb dipropionate assessing the gestation rate at 15, 30, 45 and 60 days. After 52 embryo collections, the embryonic recovery rates were 53.84% (14/26) and 65.38% (17/26) (p> 0.05) for GId and GIId, respectively. The gestation rate was 70% (14/20) (p>0.05) at 15, 30, 45 and 60 days in group GIr and for GIIr was 85% (17/20) (p>0.05) at 15 days, 80% (16/20) (p>0.05) at 30, 45 and 60 days. The treatment with imidocarb dipropionate did not cause significant improvement in the reproductive efficiency at an ET program.

Este estudo teve por objetivo avaliar a influência da infecção por Theileria equi nas taxas de recuperação embrionária, gestação e perda embrionária precoce. Foram utilizadas 13 doadoras e 40 receptoras de embrião da raça Mangalarga Marchador, positivas para Theileria equi através da técnica de nested-PCR. Nas doadoras foram realizados duas coletas de embriões em dois ciclos estrais consecutivos (GId), em sequência, esses mesmos animais foram tratados com dipropionato de imidocarb (1,2mg/kg IM.) para realização de mais duas coletas de embriões em dois ciclos estrais (GIId). As receptoras foram divididas em dois grupos de 20 animais cada, onde um grupo foi o controle (GIr) e, o outro grupo, foi tratado (GIIr) com 1,2mg/ Kg IM de dipropionato de imidocarb, com intuito de avaliar a taxa de gestação aos 15, 30, 45 e 60 dias. Após a realização de 52 coletas de embrião, as taxas de recuperação embrionária foram de 53,84% (14/26) e 65,38% (17/26) (p> 0,05) para GId e GIId, respectivamente. A taxa de gestação foi de 70% (14/20) (p>0,05) aos 15, 30, 45 e 60 dias no grupo GIr e para o GIIr foi 85% (17/20) (p>0,05) aos 15 dias, 80% (16/20) (p>0,05) aos 30, 45 e 60 dias. O tratamento com dipropionato de imidocarb não promoveu melhora significativa na eficiência reprodutiva em um programa de TE.

Viable offspring after successful non-surgical embryo transfer in goats / Nascimento de fetos viáveis após transferência de embriões não-cirúrgica em caprinos

O objetivo do presente estudo foi avaliar a viabilidade da técnica de transferência não cirúrgica em cabras. Quatro cabras não-lactantes pluríparas da raça Toggenburg foram utilizadas como receptoras de embriões, sendo que duas receberam um embriões e duas receberam dois embriões coletados não cirurgicamente cabras doadoras. Os corpos lúteos das receptoras foram detectados um dia antes da transferência de embriões por ultrassonografia transretal. Uma seringa de 5mL contendo 2mL de meio holding foi acoplada em um cateter tomcat, no qual os embriões foram aspirados em uma coluna central a duas outras colunas. Um espéculo Colin número 2 foi inserido na vulva e na vagina, e com o uso de uma fonte de luz, a cerviz foi localizada e imobilizada com uma pinça de Allis. Um cateter uretral número seis acoplado a um mandril e lubrificado com meio PBS foi inserido na cérvix, e assim os aneis cervicais foram gradualmente transpostos. Após perder a resistência, o cateter uretral foi movido lateralmente para o corno uterino desejado. O mandril e a pinça de Allis foram retirados e o conjunto seringa e tomcat foi acoplado ao cateter uretral e o conteúdo injetado no corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo com posterior retirada do cateter. Cabras que ovularam em apenas um ovário foram usadas para testar a eficiência da deposição do embrião. O tempo gasto entre a inserção do espéculo e a sua remoção foi inferior a três minutos. O tempo para transpor a cérvix foi inferior a um minuto. A ultrassonografia revelou a deposição de líquido no corno desejado. Receptoras que receberam dois embriões tornaram-se gestantes e pariram três crias. Estes primeiros resultados encorajam a técnica e demonstram que a transferência de embriões em caprinos pode ser feita totalmente por procedimentos não cirúrgicos...

Relationship between pregnancy rate and serum progesterone concentration in cases of porcine embryo transfer

The level of P4 at the time of embryo transfer (ET) is important. P4 concentrations and numbers of corpora lutea for 126 recipients were evaluated. Nuclear transfer embryos were transferred into 126 surrogates. 11 maintained their pregnancy until full-term delivery, 17 miscarried, and implantation failed in 98 animals. P4 levels in the full-term group were significantly different from those of the pigs that aborted or in which implantation failed (p < 0.05). However, the numbers of corpora lutea were not significantly different. These findings indicate that the concentration of progesterone can be an important factor for successful ET in pigs.

Effect of superovulation on uterine and serum biochemical parameters and its potential association with transferable embryos in Holstein dairy cows

The objective of this study was to determine the effects of superovulation (SOV) on serum and uterine biochemical parameters, uterine bacteriology and cytology and number of transferable embryos (TE). Dairy cows were placed on a Presynch/CIDR Synch protocol. The SOV group was superovulated, induced in estrus, and inseminated, whereas the control group was induced in estrus and inseminated without SOV. Uterine bacteriology and cytology and uterine and serum biochemical parameters were measured at day 7 of the estrous cycle to start the SOV protocol, as well as on the day of embryo recovery (DER). The SOV group produced 7.5 +/- 6.7 oocytes/embryos, of which 3.4 +/- 4.7 were TE. Serum urea and E2 and uterine Glu, CK, LDH, TP, P4 and PGFM in the control group and serum P4 and PGFM and uterine LDH and PGFM in the SOV group were significantly higher (p < 0.01) at DER than day 7. At DER, uterine urea, LDH, PGFM and TP and serum urea, LDH, PGFM, and P4 concentrations were higher (p < 0.01) in the SOV group than the control. There was no significant variation in uterine bacteriology or cytology. Overall, these results infer that SOV affects both serum profile and uterine secretions, and that these changes may influence the number of TE.

Desempenho reprodutivo entre receptoras bovinas não contaminadas e naturalmente infectadas por Neospora caninum, após a transferência de embriões / Reproductive performance in bovine receipts non infected and naturally infected with Neospora caninum after embryo transfer

O uso do conhecimento de biotécnicas para a melhoria da produção de bens e serviços tem avançado significativamente. O controle de doenças infecciosas continua a representar o maior obstáculo para a saúde dos animais. A perda embrionária pode ser responsável pelo aumento de prejuízos econômicos isolados para os produtores de bovinos. A infecção por Neospora caninum tem emergido como uma importante doença reprodutiva e, em vários países, tem sido diagnosticada como principal causa de aborto. O objetivo desse trabalho foi comparar o desempenho reprodutivo em receptoras bovinas não contaminadas e naturalmente infectadas por Neospora caninum após a transferência de embriões (TE). A escolha dos animais (n=395) para o experimento foi realizada através de avaliação ginecológica, via palpação transretal. As vacinações seguiram protocolo sanitário recomendado para a TE. O manejo nutricional foi baseado no National Research Council (NRC, 1999). A TE de embriões descongelados foi feita após a sincronização do ciclo estral das receptoras. Para a avaliação do desempenho reprodutivo se utilizou de ultrassonografia transretal. A identificação das receptoras positivas para Neospora caninum realizou-se através do teste de ELISA e, para as amostras reagentes, confirmação através de imunofluorescência indireta (IFI). Os dados foram analisados utilizando Past® e foram considerados estatisticamente significantes (P<0,01). Os resultados mostram uma taxa de prenhes (n=191) de 48,35%, seguida de uma taxa de abortos aos 60 dias de gestação (n=14) de 3,5% e abortos ao sexto mês de gestação (n=12) de 3,04%. Esses resultados tornam-se relevantes quando se leva em consideração que, receptoras infectadas pelo protozoário não apresentaram uma taxa elevada de perdas gestacionais. A insignificância estatística dos dados obtidos nesse estudo confere a segurança em sugerir que não há necessidade em implantar o diagnóstico ou controle prévios para Neosporose em rebanhos aptos a TE.

The use of knowledge in biotechnologies for improving the production of goods and services has advanced significantly. The control of infectious diseases continues to represent the most obstacle to the health of animals. The embryonic loss may be responsible for the increase in economic losses for producers isolated from cattle. Infection with Neospora caninum has emerged as an important reproductive disease and, in several countries, has been diagnosed as the main cause of abortion. The aim of this study was to evaluate the reproductive performance in not contaminated and naturally infected with Neospora caninum bovine receipt after embryos transfer (ET). The choice of animals (n=395) for the experiment was performed by gynecological evaluation, via transrectal palpation. Vaccinations recommended for health protocol followed the ET. Nutritional management was based on the National Research Council (NRC, 1999). The ET of thawed embryos was made after the synchronization of the estrous cycle of the receipts. To evaluate the reproductive performance of transrectal ultrasonography was used. The identification of the positive receipts for Neospora caninum was performed by ELISA and reagents for samples, confirmation by indirect immunofluorescence (IIF). Data were analyzed using Past® and were considered statistically significant (P<0.01). The results show a rate of pregnant (n=191) of 48.35%, followed by an abortion rate at 60 days of gestation (n=14) and 3.5% of abortions in the sixth month of gestation (n=12) of 3.04%. These results become relevant when taking into consideration that infected receipts by the protozoan not showed a high rate of pregnancy loss. The statistical insignificance of the data obtained in this study provides the security suggesting that there is no need to deploy the diagnosis or prior control to neosporosis in receipts able to ET.

epididymal sperm viability, motility and DNA integrity in dead mice maintained at 4-6[degree sign]C

When male animals die, spermatozoa within the body of animal will be degenerated. Because of unique chromatin structure of sperm, maybe this degeneration is different from other cells. However there is not any research which considered directly the integrity of sperm DNA by keeping the cadaver in refrigerator. The aim of this study was to assess viability, total motility and DNA integrity of sperm cells after death. In this experimental study, 24 male Swiss white mice were killed by cervical dislocation and then kept in refrigerator [4-6[degree sign] C] for up to 12 days. On the 0 [immediately after death as control group], 1[st], 2[nd], 3[rd], 5[th], 7[th], 10[th] and the 12[th] days after death cauda epididymides were removed and squeezed in Ham's F10 medium. The proportion of viable, motile and double stranded DNA spermatozoa was examined. Viability and DNA integrity of sperm cells were examined consecutively by eosin nigrosin and acridine orange stainings. The data obtained from this study showed that viability and total motility of sperm cells were significantly decreased during 12 days after death [p<0.001]. In contrast with viability and motility, DNA integrity was without significant changes [even 12 days after death]. This study suggests that integrity of sperm DNA would not change even after 12 days after death if the cadaver kept in refrigerator

Mitochondrial and DNA damage in bovine somatic cell nuclear transfer embryos

The generation of reactive oxygen species (ROS) and subsequent mitochondrial and DNA damage in bovine somatic cell nuclear transfer (SCNT) embryos were examined. Bovine enucleated oocytes were electrofused with donor cells and then activated by a combination of Ca-ionophore and 6-dimethylaminopurine culture. The H2O2 and .OH radical levels, mitochondrial morphology and membrane potential (DeltaPsi), and DNA fragmentation of SCNT and in vitro fertilized (IVF) embryos at the zygote stage were analyzed. The H2O2 (35.6 +/- 1.1 pixels/embryo) and .OH radical levels (44.6 +/- 1.2 pixels/embryo) of SCNT embryos were significantly higher than those of IVF embryos (19.2 +/- 1.5 and 23.8 +/- 1.8 pixels/embryo, respectively, p < 0.05). The mitochondria morphology of SCNT embryos was diffused within the cytoplasm. The DeltaPsi of SCNT embryos was significantly lower (p < 0.05) than that of IVF embryos (0.95 +/- 0.04 vs. 1.21 +/- 0.06, red/green). Moreover, the comet tail length of SCNT embryos was longer than that of IVF embryos (515.5 +/- 26.4 microm vs. 425.6 +/- 25.0 microm, p < 0.05). These results indicate that mitochondrial and DNA damage increased in bovine SCNT embryos, which may have been induced by increased ROS levels.

Improved assessment of frozen/thawed mouse spermatozoa using fluorescence microscopy

Genetically modified (GM) animals are unique mutants with an enormous scientific potential. Cryopreservation of pre-implantation embryos or spermatozoa is a common approach for protecting these lines from being lost or to store them in a repository. A mutant line can be taken out of a breeding nucleus only if sufficient numbers of samples with an appropriate level of quality are cryopreserved. The quality of different donors within the same mouse line might be heterogeneous and the cryopreservation procedure might also be error-prone. However, only limited amounts of material are available for analysis. To improve the monitoring of frozen/thawed spermatozoa, commonly used in vitro fertilization (IVF) followed by embryo transfer were replaced with animal-free techniques. Major factors for assessing spermatozoa quality (i.e., density, viability, motility, and morphology) were evaluated by fluorescence microscopy. For this, a live/dead cell staining protocol requiring only small amounts of material was created. Membrane integrity was then examined as major parameter closely correlated with successful IVF. These complex analyses allow us to monitor frozen/thawed spermatozoa from GM mice using a relatively simple staining procedure. This approach leads to a reduction of animal experiments and contributes to the 3R principles (replacement, reduction and refinement of animal experiments).

Técnicas de reproducción asistida en caballos / Assisted reproductive technologies in the horses / Técnicas de reprodução assistida em cavalos

Las técnicas de reproducción asistida son métodos no convencionales por los cuales se obtienen potros deyeguas problema o geriátricas mediante la obtención de oocitos viables. De esta manera, los problemas del úteroo del oviducto que impiden un buen transporte y sobrevivencia de los espermatozoides, adecuada fertilizacióny consecuentemente transporte del embrión, son sobrepasados. Existen primordialmente dos métodos paracolectar oocitos en yeguas – a partir del folículo pre-ovulatorio dominante o de todos los folículos visiblesen los ovarios. Además existen dos métodos para fertilizar los oocitos que han sido obtenidos: in vitro, porinyección intracitoplasmatica de un espermatozoide (ICSI) o in vivo, al transferirlo al oviducto de una yeguareceptora inseminada previamente (Transferencia de oocitos)

Assisted reproductive technology (ART) refers to non-conventional methods for obtaining foals by obtainingisolated oocytes in problematic or geriatric mares. In this way, problems with the mare’s uterus or oviductthat limit proper sperm transport and survival, adequate fertilization, and consequently embryo transportare bypassed. There are two main methods to recover oocytes from a valuable mare – from the dominantpreovulatory follicle, or from all visible follicles on the ovaries. In addition, there are two main methods tofertilize the recovered oocytes: in vitro, by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) or in vivo, by transferringit to the oviduct of a previously inseminated recipient mare (Oocyte Transfer)

As técnicas de reprodução assistida são métodos não-convencionais para a obtenção de potros de éguasproblemáticas ou geriátricas, através da retirada de ovócitos viáveis. Assim, os problemas do útero ou do ovídutoque impedem o transporte e a sobrevivência de espermatozoides, a fertilização adequada e, consequentemente,o transporte do embrião são evitados. Existem principalmente dois métodos para coletar ovócitos em éguas– a partir do folículo pré-ovulatório dominante, ou de todos os folículos visíveis nos ovários. Há tambémdois métodos para fertilizar os ovócitos que foram obtidos: in vitro, através de injeção intracitoplasmáticade espermatozoides (ICSI) ou in vivo, transferido-os para o oviduto de uma égua destinatária previamenteinseminada (Transferência de ovócitos).

Correlação entre os métodos de concepção, ocorrência e formas de tratamento das onfalopatias em bovinos: estudo retrospectivo / Correlation between conception methods, occurrence, and type o treatment of the umbilical diseases in cattle: a retrospective study

Alguns problemas têm sido observados nos bezerros produtos da técnica fertilização in vitro, dentre esses a elevada casuística de onfalopatias. A partir dessa observação, objetivou-se com este trabalho realizar um estudo retrospectivo da correlação entre os métodos de concepção e a ocorrência de onfalopatias em bovinos e descrever os resultados obtidos a partir dos tratamentos conservativo e cirúrgico. Foram utilizados 44 bovinos atendidos no Hospital Veterinário da Unesp, Campus de Araçatuba, com idade variando de um dia a 12 meses entre os anos de 2003 e 2007. Desses bovinos 27 eram provenientes de fertilização in vitro (FIV), 12 de inseminação artificial (IA), dois de monta natural (MN) e três de transferência de embriões (TE). O diagnóstico clínico-cirúrgico revelou que todos apresentavam afecções umbilicais, sendo 22 casos de persistência de úraco, oito de onfaloflebite, oito de hérnias umbilicais, cinco de onfalites e um de fibrose umbilical. Inicialmente e no pós-operatório administrou-se em todos os animais, uma vez ao dia, durante dez dias, 3mg/kg de ceftiofur sódico pela via intravenosa (IV). Nos casos de infecção grave ou irresponsiva a terapia antimicrobiana inicial, acrescentou-se 6,6mg/kg, durante sete dias de sulfato de gentamicina IV. A antissepsia do umbigo, com tintura de iodo a 2 por cento, foi instituída duas vezes ao dia, nos casos tratados conservativamente, enquanto que os bovinos submetidos à cirurgia receberam 1,1mg/kg de flunixin meglumine IV, uma vez ao dia, por cinco dias consecutivos. Dos 22 animais diagnosticados com persistência de úraco, 10 apresentavam drenagem de urina pelo umbigo e receberam 2mL de tintura de iodo 10 por cento no interior do úraco, sendo 15 tratados com a excisão cirúrgica, especialmente, devido à formação de divertículo vésico-uracal. Todos os animais que apresentavam onfaloflebite e hérnia umbilical foram submetidos à cirurgia...

Some problems have been observed in bovine products of the in vitro fertilization technical, among these, the high umbilical diseases casuistry. From this observation, the aim of this work was to accomplish a retrospective study of the correlation between the conception methods and the occurrence of umbilical diseases in bovines and describe the results obtained from the conservative and surgical treatments. For this 44 animals attended at Veterinary Teaching Hospital of Unesp Araçatuba, with age varying from one day to 12 months among the years of 2003 and 2007 were used, twenty seven were from in vitro fertilization (IVF), twelve were from artificial insemination (AI), two were from natural mounts and three were from embryo transfer. The clinical-surgical diagnosis of the animals revealed that all of them presented umbilical disorders, being 22 cases of urachus patent, eight omphalophlebitis, eight umbilical hernia, five omphalitis and one umbilical fibrosis. Before and at the postoperative period was administered in all animals once a day for ten days 3mg/kg of ceftiofur sodium IV. In cases of serious infection or lack of response of the initial antimicrobial therapy a complementary treatment during seven days with 6.6 mg/kg of gentamicin sulfate IV was carried out. The antisepsis of the umbilicus with tincture of iodine to 2 percent was carried out twice daily in cases treated clinically, with out surgery, while the animals underwent surgery received 1.1mg/kg of flunixin meglumine IV once daily for five consecutive days.Among the 22 animals diagnosed with urachus patent, 10 had urine drainage from the umbilicus and received 2mL of 10 percent tincture of iodine in the urachus, and 15 was treated with surgical excision, due to formation of diverticulum from the blader to urachus. All animals that were affected with omphalophlebitis and umbilical hernia were submitted to surgery...

Utilização do primeiro ciclo ovulatório da estação reprodutiva para produção de embriões em éguas sob condições tropicais / Utilization of the first ovulatory cycle of seasonal breeding for embryo production in mares in tropical conditions

A eficiência da primeira ovulação da estação reprodutiva para a produção de embriões foi determinada através da taxa de recuperação embrionária, da viabilidade dos embriões recuperados, da concentração sérica de progesterona, da resposta do primeiro folículo pré-ovulatório da estação reprodutiva ao hCG e da resposta do primeiro CL a PGFa alfa. Treze éguas que estavam no periodo de anestro ou inicial da transição de primavera foram acompanhadas por ultra-sonografia até a detecção do primeiro folículo pré-ovulatório. Neste momento a ovulação foi induzida com 2500 UI de hCG (IV) e elas foram inseminadas em dias alternados até a ovulação. Sete dias após a detecção da ovulação foi realizada coleta de embrião e a concentração de P 4 foi determinada. A partir da detecção do primeiro folículo > e =25mm da estação, as éguas demoraram em média 14,92± 10,80 dias para alcançarem o primeiro folículo pré-ovulatório e 18,00 ±11,08 dias para ovularem, sendo que 11/13 éguas ovularam em até 48 horas após a administração do hCG. Estes folículos cresceram em média 2,19± 0,86 mm/dia. Nove das 13 éguas (69,2%) produziram embriões e todos foram considerados viáveis após avaliação visual e pelo exame de fluorescência. Os corpos lúteos formados mostraram-se funcionalmente competentes produzindo em média 7,39 ± 2,11 ng/ ml de P 4, além de serem responsivos à PGF2alfa. Deste modo, o primeiro ciclo ovulatório do ano pode ser utilizado com sucesso para a produção de embriões viáveis.

The efficacy of the first ovulation of the breeding season was determined through the response of first pre-ovulatory follicle of the breeding season to hCG, embryo recovery rate, viability of recovered embryos, serum concentrations of progesterone, and response of first CL to PGF2 alpha. Thirteenth mares that were in vernal transition were accompanied until the first pre-ovulatory follicle was detected. At this moment, the ovulation was induced with 2,500 IU hCG (IV) and the mares were inseminated every other day until ovulation. Seven days after the ovulation, embryo recovery was performed and the progesterone concentration was determined. After detection of the first pre-ovulatory follicle of breeding season with > and = 25mm, it took 14.92 ± 10.80 days for the follicle to reach the pre-ovulatory size and 18.00 ± 11.08 days to ovulation. After administration of hCG, 11/13 mares ovulated in 48 hours. These follicles growth 2.19 ± 0.86 mm/ day on average. Nine of 13 mares (69.2%) produced embryos and ali were considered viable after morfological evaluation and fluorescence exams. The CL appeared competent producing 7.39 ± 2.11 ng/ml P4 on average, and responding to PGF2 alpha. According to these results the first ovulatory cycle of the year can be utilized to produce viable embryos.

Genetic trend for milk yield in Guzerat herds participating in progeny testing and MOET nucleus schemes

Genetic trends for 305-day milk yield (P305) in Brazilian Guzerat herds under selection were compared. Data from 4898 lactations of 3179 purebred and crossbred cows from various regions of Brazil were used. Milk yield was adjusted for mature age and the contemporary groups were defined as herd and calving year. Genetic parameters were estimated using the MTDFREML program. The model included the random effects of animals and permanent environment, and herd-calving year, calving season and genetic composition as fixed effects. Genetic trends were estimated by linear regression of weighted average estimated breeding values as a function of calving year. The average P305 was 2065 ± 922 kg and the heritability was 0.23 ± 0.03. The annual genetic trend in estimated breeding values of cows for P305 was 7.09 ± 0.71 kg between 1987 and 2004, and 6.47 ± 2.35 kg between 1997 and 2004. For cows born and raised in the multiple ovulation and embryo transfer (MOET) nucleus, this trend was 36.46 ± 24.54 kg/year between 1997 and 2004, 183.14 ± 47.94 kg/year between 1997 and 2000, and 9.13 ± 19.19 kg/year between 2001 and 2004. An average inbreeding coefficient of 0.04 was found for inbred MOET cows in 2004. Increasing the size of the family and introducing new progenies changed reliabilities and predicted transmitting ability estimates of MOET sires. In conclusion, there was a positive genetic trend for milk yield in the MOET nucleus at low inbreeding coefficients due to the increased accuracy and estimated genetic merit, but no changes in the average milk yield were observed.

Selecão para producão de leite em núcleos MOET das racas zebuínas: um estudo de simulacão / Selection to milk production in Zebu MOET nuclei: a simulation study

Um programa estocástico de selecão em núcleo MOET, esquema adulto, com geracão discreta e populacão panmítica finita, foi simulado para uma característica influenciada por grande número de locos, mediante um modelo estocástico. Foram consideradas as herdabilidades de 0,25, 0,35 e 0,45 e a repetibilidade de 0,50. Os fatores utilizados na definicão dos esquemas alternativos de núcleo MOET estudados foram: tamanho da populacão (N), estratégia de acasalamento (A), número de progênies MOET nascidas (P) e número de reprodutores selecionados por grupo de irmãos completos (R). Os tamanhos de populacão que constituíram a geracão base do núcleo foram: 16 doadoras/8 reprodutores; 16 doadoras/4 reprodutores e 32 doadoras/4 reprodutores. Na estratégia hierárquica (H) de acasalamento, cada doadora foi acasalada com apenas um reprodutor, enquanto na estratégia fatorial de acasalamento, cada doadora foi acasalada com dois (F-I) ou quatro (F-II) reprodutores por geracão. Considerou-se o nascimento de quatro ou oito progênies MOET por doadora a cada superovulacão. O número de reprodutores selecionados foi limitado a um ou dois de cada grupo de irmãos completos. Para as três estratégias de acasalamento (H, F-I e F-II), foi utilizado o intervalo de geracões (IG) de 3,89 anos e, para a estratégia F-II, o IG de 4,15 anos. Todos os fatores utilizados na definicão dos esquemas alternativos influenciaram (P<0,05) os resultados do ganho genético nas três herdabilidades consideradas. O efeito de algumas interacões (N A, N R e P A) também foi significativo (P<0,05). A interacão A R influenciou (P<0,05) apenas nas herdabilidades de 0,25 e 0,35. Para a taxa de endogamia, verificou-se influência (P<0,05) de todos os fatores estudados para as três herdabilidades. O efeito das interacões N P, N A, N R e P A também foi significativo (P<0,05) sobre a taxa de endogamia. Verificou-se que a eficiência do MOET em produzir estruturas viáveis e prenhezes positivas, bem como o grau de reducão no IG, constituem os principais aspectos responsáveis pela taxa de progresso genético nos esquemas de selecão em núcleos MOET.

Pré-tratamento com somatotropina bovina (rbST) na superovulação de doadoras da raça Holandesa / Pre-treatment with bovine somatotropin (rbST) in the superovulation of Holstein donors

Estudou-se o efeito da somatotropina bovina recombinante (rbST) sobre o número e qualidade dos embriões de 40 vacas da raça Holandesa, distribuídas aleatoriamente em três grupos: controle (GI, n=15), tratadas com 250mg de rbST (GII, n=11) e tratadas com 500mg de rbST (GIII, n=14) no sexto dia do ciclo estral. No décimo dia após o estro, as doadoras foram submetidas ao tratamento superovulatório com 360mg de hormônio folículo estimulante (FSH) em doses decrescentes, duas vezes ao dia, com intervalos de 12 horas. Juntamente com a sétima aplicação de FSH foram administrados 0,5mg de cloprostenol (análogo da PGF2alfa) e as doadoras inseminadas artificialmente 12, 20 e 28 horas após o início da manifestação de estro. Os embriões foram coletados, não cirurgicamente, no sétimo dia após a primeira inseminação. A administração de 250 ou 500mg de rbST aumentou (P<0,05) o percentual de embriões viáveis e não alterou a taxa de gestação das receptoras.